ВТОРИННИЙ РІСТ У ДИХАЛЬНО-ДЕФІЦИТНОМУ ШТАМІ ДРІЖДЖІВ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ВНАСЛІДОК ДЕЛЕЦІЇ ГЕНА YKU70
DOI 10.17721/1728_2748.2020.82.53-58
Ключові слова:
Saccharomyces cerevisiae, вторинний ріст, YKU70, мікросателітна нестабільністьАнотація
Відомо, що вагомими причинами розвитку злоякісних пухлин є дестабілізація ядерного геному та порушення функціонування мітохондрій. Виникнення вторинного росту на колоніях дріжджів (поява більш пристосованих до несприятливих умов клітинних субпопуляцій в умовах загибелі вихідної культури) використовують як модель початкових етапів канцерогенезу. Для вивчення особливостей формування адаптивного росту було створено репараційно-дефектний і дихально-дефіцитний штам дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Як індуктор нестабільності ядерного геному застосовано термочутливу мутацію в гені yku70 (при 37 оС викликає зупинку клітинного циклу внаслідок скорочення довжини теломерних ділянок хромосом). Пошкодження мітохондріальної ДНК ∆yku70 штаму призвело до його дихально-дефіцитного стану (петіт мутація). Виділений петіт мутант ∆yku70 штаму культивували за оптимальної 28 оС та рестриктивної 37 оС температур, стан клітинної суспензії оцінювали за допомогою світлової та люмінесцентної мікроскопії, для визначення життєздатності клітин використовували аналіз росту мікроколоній. Проведено виділення клонів вторинного росту та аналіз їх властивостей методом серійних розведень. Для оцінювання стабільності дріжджового геному виділених клонів вторинного росту використано ПЦР-аналіз мікросателітних послідовностей YOR267C, SC8132X, SCPTSY7. При культивуванні петіт мутанта штаму ∆yku70 при рестриктивній температурі 37 оС на 7-му добу виявлено утворення життєздатних субпопуляцій, які можуть здолати зупинку клітинного циклу в G2/M фазі. Подальший аналіз виділених клонів вторинного росту показав, що вони відрізняються за виживаністю клітин при рестриктивній температурі, стійкостю до УФ випромінювання та здатністю до утворення вторинного росту на колоніях. За аналізу мікросателітних повторів у клонів вторинного росту не виявлено проявів нестабільності досліджуваних послідовностей.
Посилання
1. Addinall SG, Downey M, Yu M, et al. A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 2008;180(4):2251-2266.
2. Ausubel F. Current Protocols in Molecular Biology H; NJ: USA, 2001.
3. Cazzanelli G, Pereira F, Alves S, et al. The Yeast Saccharomyces cerevisiae as a Model for Understanding RAS Proteins and their Role in Human Tumorigenesis. Cells. 2018;7(2):14.
4. Fabrizio P, Battistella L, Vardavas R, Gattazzo C, Longo VD Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae .The Journal of Cell Biology 2004; 166(7):1055-1067.
5. Fell VL, Schild-Poulter C. The Ku heterodimer: Function in DNA repair and beyond. Mutat. Res. – Rev. Mutat. Res. 2015; 763:15–29.
6. Field D. Abundant microsatellite polymorphism in Saccharomyces cerevisiae, and the different distributions of microsatellites in eight prokaryotes and S. cerevisiae, result from strong mutation pressures and a variety of selective forces. Proc. Natl. Acad. Sci. 1998; 95(4):1647–1652.
7. Fitzgerald DM, Hastings PJ, Rosenberg SM. Stress-Induced Mutagenesis: Implications in Cancer and Drug Resistance. Annu Rev Cancer Biol. 2017;1:119-140.
8. Ju Y. et al. Decreased expression of DNA repair proteins Ku70 and Mre11 is associated with aging and may contribute to the cellular senescence. Exp. Mol. Med. 2006; 38(6):686–693.
9. Lee SE, Moore JK, Holmes A, Umezu K, Kolodner RD, Haber JE. Saccharomyces Ku70, Mre11/Rad50 and RPA Proteins Regulate Adaptation to G2 / M Arrest after DNA Damage. Cell. 1998; 94(3):399–409.
10. Loilome, W., Kadsanit, S., Muisook, K., Yongvanit, P., Namwat, N., Techasen, A., Puapairoj, A., Khuntikeo, N., Phonjit, P."Imbalanced adaptive responses associated with microsatellite instability in cholangiocarcinoma". Oncology Letters 2017; 13(2): 639-646.
11. Lõoke M, Kristjuhan K, Kristjuhan A. Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 2011; 50(5):325–328.
12. Mario G. Mirisola, Ralf J. Braun, Dina Petranovic, Approaches to study yeast cell aging and death, FEMS Yeast Research, 2014; 14 (1):109–118.
13. Meyer RR, Simpson MV. DNA Biosynthesis in Mitochondria: Differential Inhibition of Mitochondrial and Nuclear DNA Polymerases by the Mutagenic Dyes Ethidium Bromide and Acriflavin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1969; 34: 238-244.
14. Natali, F., & Rancati, G. The Mutator Phenotype: Adapting Microbial Evolution to Cancer Biology. Frontiers in genetics, 2019; 10, 713.
15. Putnam CD, Kolodner RD. Pathways and Mechanisms that Prevent Genome Instability in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 2017;206(3):1187-1225.
16. Skoneczna A, Kaniak A, Skoneczny M. Genetic instability in budding and fission yeast-sources and mechanisms. FEMS Microbiol Rev. 2015;39(6):917-967.
17. Smith, Stephanie et al. "Dynamic regulation of single-stranded telomeres in Saccharomyces cerevisiae." Genetics vol. 178,2 (2008): 693-701.
18. Steensma HY, Holterman L, Dekker I, van Sluis CA, Wenzel TJ. Molecular cloning of the gene for the E1 alpha subunit of the pyruvate dehydrogenase complex from Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 1990; 191(3):769–74.
19. Vaudano E, Garcia-Moruno E. Discrimination of Saccharomyces cerevisiae wine strains using microsatellite multiplex PCR and band pattern analysis. Food Microbiol. 2008; 25(1):56–64.
20. Vodenicharov MD, Laterreur N, Wellinger RJ. Telomere capping in non-dividing yeast cells requires Yku70 and Rap1. EMBO J. 2010; 29(17):3007–3019.
21. Wallace D. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine/.Annu Rev Genet. 2005; 39:359–407.
22. Wang H, Elledge SJ. Genetic and physical interactions between DPB11 and DDC1 in the yeast DNA damage response pathway. Genetics. 2002; 160(4):1295–304.
23. Zubko EI, Zubko MK. Deficiencies in mitochondrial DNA compromise the survival of yeast cells at critically high temperatures. Microbiol. Res. 2014; 169(2–3):185–195.
24. Zubko MK, Guillard S, Lydall D. Exo1 and Rad24 differentially regulate generation of ssDNA at telomeres of Saccharomyces cerevisiae cdc13-1 mutants. Genetics. 2004; 168(1):103–15.
25. Nikitina ET. Vtorychniy rost u microorganismov. Almaty: RIO VAK RK, 2000. Russian.
26. Petrachkova TA, Pronina OV, Shepeta YB, Rushkovsky SR. Vlyyanyya mutatsyy cdc13-1 na sostoyanye kletochnoy populyatsyy drozhzhey Saccharomyces cerevisiae. Dostyazhenyya y problemy henetyky, selektsyy y byotekhnolohyy: zbirnyk naukovykh prats. 2012; 4:386-390. Russian.
27. Pronina OV, Petrachkova TA, Shepeta YB, Rushkovs'kyy SS. Vplyv vtraty mitokhondrial'njyi DNK na protsesy starinnya v koloniyakh drizhdzhiv Saccharomyces cerevisiae. Zbirnik naukovykh prats' "Factory eksperymental'noyi evolyutsiyi orhanizmiv", Kyiv, Lohos. 2011; 10: 69-73. Russian.
