ОПТИМІЗАЦІЯ МЕТОДУ ЕНЗИМ-ЕЛЕКТРОФОРЕЗУДЛЯ ВИКОРИСТАННЯ ЯК СУБСТРАТ КОЛАГЕНУ
DOI: 10.17721/1728.2748.2023.94.41-45
Ключові слова:
enzyme electrophoresis, collagen, collagenolytic activity, proteolytic activityАнотація
Вступ. Представлено оптимізований метод ензим-електрофорезу з використанням колагену як субстрат. Основними параметрами, що впливають на ефективність та роздільну здатність методу, є ступінь розведення проб, концентрація розподільчого гелю, концентрація розчину колагену, кополімеризованого в розподільчий гель та час продовження електрофоретичного розділення.
Методи. Для того, щоб дослідити всі активні та проактивні форми плазміну, усі зразки були приготовлені у двох варіаціях: з додатковою активацією, шляхом додавання стрептокінази (Ск), та без неї. Для отримання чітко видимих точок лізису зразки із Ск розводили у співвідношенні 1:16, а зразки без Ск розводили у співвідношенні 1:8. Для запобігання міграції субстрату та втрати електрофоретичної рухливості білків використовували розподільчий гель з концентрацією 15 %, а концентрація розчину колагену, кополімеризованого в гель, становила 1 мг/мл. Для отримання найбільш інформативних результатів час продовження електрофоретичного розділення становив 15 хв. Після електрофорезу гелі відмивали в 2,5 % розчині Тритон Х-100 протягом 1 год та фарбували відповідно до стандартного протоколу.
Результати. У результаті проведенних досліджень було знайдено оптимальні умови проведення модифікації ензим-електрофорезу згідно з усіма аналітичними маніпуляціями та показано методичні підходи до виявлення латентних проферментних форм ензимів, яким властива колагенолітична активність.
Висновки. Описану модифіковану методику можна використовувати для кількісного та якісного аналізу наявності колагенолітичної активності в різних зразках, що дозволяє проводити дослідження ферментів, яким властива така активність, як з наукових позицій, так і в процесі пошуку та розроблення технологій отримання ферментів-колагенолітиків для біотехнологічних цілей.
Посилання
Bratchik AM. Clinical Problems of Fibrinolysis. Zdorovye. 1993;344
Choi NS, Kim BH, Park CS, Han YJ, Lee HW, Choi JH, Lee SG, Song JJ. Multiple-layer substrate zymography for detection of several enzymes in a single sodium dodecyl sulfate gel. Anal Biochem. 2009;386(1):121-122. doi:10.1016/j.ab.2008.11.007
Choi NS, Yoo KH, Yoon KS, Maeng PJ, Kim SH. Nano-scale proteomics approach using two-dimensional fibrin zymography combined with fluorescent SYPRO ruby dye. J Biochem Mol Biol. 2004;37(3):298-303. doi:10.5483/bmbrep.2004.37.3.298
Gogly B, Groult N, Hornebeck W, Godeau G, Pellat B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Anal Biochem. 1998;255(2):211-216. doi:10.1006/abio.1997.2318
Kundapur R. Zymography: Enzymes in Action. Science International. 2013;1:70-75. doi: 10.5567/sciintl.2013.70.75.
Rachkovska A, Krenytska D, Karbovskyy V, Raksha N, Halenova T, Vovk T, Savchuk O, Ostapchenko L. A study of fibrinolytic system components in donor groups depending on various titers of circulating anti-SARS-CoV-2 IgG in the bloodstream. Blood Coagul Fibrinolysis. 2023;34(7):439-445. doi: 10.1097/MBC.0000000000001248
Snoek-van Beurden PA, Von den Hoff JW. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Biotechniques. 2005;38(1):73-83. doi: 10.2144/05381RV01
Tajhya RB, Patel RS, Beeton C. Detection of Matrix Metalloproteinases by Zymography. Methods Mol Biol. 2017;1579:231-244. doi: 10.1007/978-1-4939-6863-3_12
Wilkesman J, Kurz L. Protease analysis by zymography: a review on techniques and patents. Recent Pat Biotechnol. 2009;3(3):175-184. doi: 10.2174/187220809789389162
Wiman B, Wallén P. Activation of human plasminogen by an insoluble derivative of urokinase. Structural changes of plasminogen in the course of activation to plasmin and demonstration of a possible intermediate compound. Eur J Biochem. 1973;36(1):25-31. doi: 10.1111/j.1432-1033.1973.tb02880.x
Bratchik AM. Clinical Problems of Fibrinolysis/ A. M. Bratchik // Zdorovye. – 1993. – P. 344
Choi NS. Multiple-layer substrate zymography for detection of several enzymes in a single sodium dodecyl sulfate gel / N. S. Choi, B. H. Kim, C. S. Park [et al.] // Analytical Biochemistry. – 2009. – Vol. 386, N 1. – P. 121–122. – Available from: https://doi.org/10.1016/j.ab.2008.11.007
Choi NS. Nano-scale Proteomics Approach Using Two-dimensional Fibrin Zymography Combined with Fluorescent SYPRO Ruby Dye / N. S. Choi, K. H. Yoo, K. S. Yoon [et al.] // BMB Reports. – 2004. – Vol. 37, N 3. – P. 298–303. – Available from: https://doi.org/10.5483/bmbrep.2004.37.3.298
Gogly B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase / B. Gogly, N. Groult, W. Hornebeck [et al.] // Analytical biochemistry. – 1998. – Vol. 255, N 2. – P. 211–216. – Available from: https://doi.org/10.1006/abio.1997.2318
Kundapur RR. Zymography: Enzymes in Action / R. R. Kundapur // Science International. – 2013. – Vol. 1, N 4. – P. 70–75. – Available from: https://doi.org/10.5567/sciintl.2013.70.75
Rachkovska A. A study of fibrinolytic system components in donor groups depending on various titers of circulating anti-SARS-CoV-2 IgG in the bloodstream / A. Rachkovska, D. Krenytska, V. Karbovskyy [et al.] // Blood Coagulation & Fibrinolysis. – 2023. – Vol. 34, N 7. – P. 439–445. – Available from: https://doi.org/10.1097/mbc.0000000000001248
Snoek-van Beurden PA. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors / P. A. Snoek-van Beurden, J. W. Von den Hoff // BioTechniques. – 2005. – Vol. 38, N 1. – P. 73–83. – Available from: https://doi.org/10.2144/05381rv01
Tajhya RB. Detection of Matrix Metalloproteinases by Zymography / R. B. Tajhya, R. S. Patel, C. Beeton // Methods Mol Biol. – 2017. – Vol. 1579. – P. 231–244. - Available from: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6863-3_12
Wilkesman J. Protease analysis by zymography: A Review on Techniques and Patents / J. Wilkesman, L. Kurz // Recent Patents on Biotechnology. – 2009. – Vol. 3, N 3. – P. 175–184. – Available from: https://doi.org/10.2174/187220809789389162
Wiman B. Activation of human plasminogen by an insoluble derivative of urokinase. Structural changes of plasminogen in the course of activation to plasmin and demonstration of a possible intermediate compound / B. Wiman, P. Wallen // European Journal of Biochemistry. – 1973. – Vol. 36, N 1. – P. 25–31. – Available from: https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1973.tb02880.x
